【近红外小动物活体成像】活体小动物脓毒症肠道模型的光声 ...

摘要

微循环功用正常与否是反映危重病人器官生理状态的关键指标，为肯定后续治疗伎俩提供了重要依据。传统上采用显微镜等伎俩察看体表微循环状态，但仅能取得组织毛细血管的空间形态，功用性信息获取才干有限，难以满足临床需求。本文针对肠道内微循环监测需求构建了小型化光纤光声内窥镜，将成像探头伸入活体小动物直肠内以旋转扫描的方式中止内窥成像。在扫描过程中逐点探测由激光脉冲在生物体内激起出的超声波，能够取得消化道内壁血管空间散布；应用动静脉血在光学吸收谱上的差别，采用双波长激起取得了血氧饱和度的空间散布。基于数小时的连续监测，发现小动物患脓毒症后直肠内壁血管结构与血氧饱和度均发作明显变更。实验结果表明，该技术能够以无创方式反映出典型微循环疾病模型的功用性变更，为微循环的无创监测提供了一种新的技术途径。

关键词

光声成像；光声内窥镜；超声传感器；光纤传感器；微循环障碍

1 引 言

微循环是指微动脉与微静脉之间毛细血管中的血液循环，是供氧端（血液）与耗氧端（组织细胞）之间中止物质交流的场所与途径。人体经过微循环输送营养物质、肃清代谢产物，从而维持正常的组织生理功用[1-3]。一旦微循环功用发作异常，将惹起循环衰竭或休克，招致氧输送或摄取缺乏，惹起组织功用障碍，进而危及患者生命[4-7]。特别是关于危重症患者来说，微循环中血流量、血氧饱和度等指标能够反映其组织灌注状况和机体血液动力学的异常变更，为临床诊断提供了重要的科学依据[8]。现有技术通常对舌下微循环中止显微成像，但该计划仅能察看血管结构，无法提供血流速度、血氧饱和度等功用信息[9]；另一方面，相比于舌下，消化道血管更能精确指征微循环状态，但缺乏相应的成像伎俩[10]。假如能经过影像学伎俩对肠道内壁的微循环中止察看，就能够为急重症患者提供可贵信息，助力制定最佳救治计划。因而，展开小型化、高空间分辨率、兼具结构与功用成像才干的消化道内窥镜技术具有重要意义。

光声成像是近年来展开起来的一种新型医学成像技术，它经过探测由脉冲激光在生物体内激起出的超声波来中止成像[11-21]。光声成像的对比度来源于血红蛋白的内源性吸收[22]，能够明晰的取得诸如小鼠脑皮层等生物组织的血管结构[23]；应用不同血氧饱和度下血红蛋白在吸收谱上的差别，经过选择两个或多个不同激起波长就能取得脱氧/氧合血红蛋白在血液中的浓度，继而计算出血氧饱和度[24-28]。将光声成像装置紧缩在小型化探头中，能够对食道、胃、直肠等消化道中止内窥成像[29-30]。但由于探头内光学与超声器件尺寸受限，光声内窥成像难以统筹高空间分辨率和高灵活度，其成像才干与体外光声成像相比具有较大差距，现有光声内窥镜技术难以满足肠道微循环的功用成像需求。

针对上述问题，本文构建了光纤光声内窥镜，并对活体小动物直肠的微循环状态中止了高空间分辨率成像。该内窥镜直径仅2.75 毫米，内部包含两根功用光纤：一根担任对脉冲激起光中止引导和聚焦，另一根内置激光超声传感器，用于对光致超声信号中止探测。经过对探头中止360 度螺旋式扫描取得小动物肠道血管的空间散布，分离双波长光声激起取得了血氧饱和度的散布信息。应用该技术察看到脓毒症模型下血管数量减少、血氧饱和度明显降落。实验结果表明，本文提出的技术能够有效监测肠道内微循环发作的异常变更，有望为微循环障碍与心脑血管重症救治提供一种新的影像学伎俩。

2 内窥成像系统构建

图1 光声内窥成像探头与系统。(a) 光声成像系统框架图；(b) 旋转扫描成像表示图； (c) 内窥探头结构表示图；(d

图1 光声内窥成像探头与系统。(a) 光声成像系统框架图；(b) 旋转扫描成像表示图； (c) 内窥探头结构表示图；(d) 内窥探头截面结构；(e) 景深与成像深度表示图；(f) 光声内窥成像系统实物图。

图1(a)所示为光声内窥成像系统，系统包含内窥成像探头、双波长激起光源、旋转扫描装置和数据采集与控制模块等组成部分。我们采用两台纳秒激光器中止光声激起，应用有氧、脱氧血红蛋白在光学吸收谱上的差别，选择适合的双波长激起来中止血氧饱和度的丈量，血氧饱和度的光声丈量原理在[31-32]中已有论述。我们应用一台输出脉宽为5 ns、输出波长为532 nm 的激光器（VPFL-G-20，Newport）作为种子光，将其注入一段3 米长的单模保偏光纤（HB450-SC，Fibercore），应用拉曼非线性效应激起出第二阶Stokes 光来取得558 nm 的脉冲激光。经过旋转半波片来调整入射光的偏振态，使受激拉曼散射效应抵达最强。从光纤输出的脉冲光经带通滤波器（FB560-10，Thorlabs）滤除其它波长，只保存558nm 波长重量。另一台532 nm 激光器（AO-S-532，长春新产业）发出的光则直接经过二向色镜与558 nm 激光光束合束后一并注入到单模光纤中。我们将这两个激起光源重复频率均设为1.6 kHz，两波长的激起光脉冲时间距离设置为1.35 μs，以保障其各自激起的光声信号在时域彻底分开，互不影响。

由于内窥成像探头与外界激起光源、信号采集模块等经过多根光纤相衔接，探头旋转时将使多根光纤缠绕在一同。为完成快速、单向旋转扫描，我们在扫描装置上中止了特殊设计，将980 nm 泵浦源、光放大器、光电探测器等中止小型化并与探头中止同步旋转。如图1(a)所示， 980 nm 泵浦光注入探头端的激光传感器，信号光经掺铒光纤放大器（模块式EDFA，BG-EDFA-M1-C1-20dB-15dBm-09SM-1m-FC/APC，厦门彼格）中止光学放大，并用光电探测器（Photodetector，RX-PD-14-C-X-D-FA，深圳锐力）转换成电信号，然后用电滑环（LPC-12T-A-0205-015，深圳晶沛）将电信号输入到PC 端中止数据采集。这样旋转扫描组件只保存一根光纤与外界激起光源相衔接，脉冲激起光经过光环滑（FRSD1-1550-2m，深圳思锐达）进入探头。我们已对滑环性能中止了优化，能够保障旋转扫描过程中激起光以低损耗经过，并以稳定的光强注入成像探头。图1(b)展示了探头的螺旋式扫描成像方式，运用一台线性电机带动内窥探头深化动物肠道内部，另一台旋转电机带动内窥探头中止360°旋转，两者速度相互配合能够构成螺旋形扫描曲面。PC 端同时控制着电机的驱动、激光器的触发和数据的采集。

图1(c)所示为内窥探头结构表示图。选取长为10 cm，外径为2.75 mm 的不锈钢钢管作为探头的鞘管，将光声激起光纤与超声传感器置于鞘管内。合束后的脉冲激起光经聚焦耦合由单模光纤中止引导，将该光纤伸入内径0.2 mm、外径0.4 mm 的毛细管中并用紫外胶（NOA81，美国Norland）中止固定，然后与突变折射率透镜（GRIN，GT-LFRL-050-024-20-NC，Grintech）中止对接耦合使激起光集聚。接下来，将二者置于内径0.5 mm、外径0.7 mm 的石英管内，经过控制光纤端面与GRIN 透镜之间的间距来调理焦距大小。然后将一个尺寸为1×1×1 mm3 的直角棱镜（N-BK7，福州美泰）粘在GRIN 透镜出射端前方，使聚焦光束反射偏折后垂直注入到生物组织上。用紫外胶将两者与石英管的衔接处中止固定密封，以避免实验过程中去离子水进入石英管内部并影响激起光的光束质量。将鞘管侧面开一长约10 mm，掩盖角度为180°的天窗，使激起光束和光致超声信号能够经过。随后，在鞘管侧内放置一长约10 cm，内径为0.3 mm、外径为0.5 mm 的毛细管，将光纤超声传感器置于其中。图1(d)所示为探头的横截面结构，经过调整光纤传感器的摆放位置和主轴角度，使其信噪比抵达最佳后用紫外胶将其固定。图1(e)展示了激起光束与目的物体之间的空间关系。图1(f)展示了整个内窥成像系统的实物照片。

光纤传感器的超声探测原理已在[33]中中止过论述，扼要来说，在稀土掺杂光纤的纤芯上制备长度约3 毫米的单纵模激光器，在980 nm 半导体激光器的泵浦作用下在1550 nm 产生高相干性的激光输出。当超声波作用到光纤上时，惹起激光频率发作变更。经过频率解调装置对调频信号中止读取，恢复超声信号。该传感器能将超声信号转导放大为激光输出的频率变更，同时应用其MHz 超声频段的低噪声取得了优越的超声探测才干。成像时将整个探头置于去离子水中，为光致超声波传输提供低损耗的传输介质。

3 成像性能表征

图2 探头成像性能表征。(a) 横向空间分辨率表征措施与结果；(b) 稳定性表征措施与结果

图2 探头成像性能表征。(a) 横向空间分辨率表征措施与结果；(b) 稳定性表征措施与结果

在活体成像之前，我们先对光声内窥探头的空间分辨率中止了表征。将制造好的探头装置在步进电机上，经过转接架将其置于充溢去离子水的水箱中，水箱底部固定11 号手术刀片。如图 2(a)所示，在 PC 端设置好程序控制步进电机，带动探头沿着垂直于金属刀刃边沿的方向中止扫描，设置步进电机步长为0.625 μm。当光斑扫描至刀刃上时激起出超声信号，超声信号强度在此处发作阶跃式变更。基于测得的超声信号强度在扫描方向上的变更得到边沿扩散函数（ESF），对其在空间上作一阶微分取得线扩散函数（LSF），从而得出成像探头的横向分辨率为12.5 μm。图1(e)所示为探头景深与成像深度表示图，景深（ depthof field）定义为，在理想的非散射介质下，被成像物距离焦距多远依旧能够具有足够的分辨率，通常为分辨率降落一半的距离。在我们的探头中，由GRIN 透镜的数值孔径以及工作波长决议，经测试文中探头在被测物体距光束焦点±0.6mm 处探头的横向分辨率为25μm，因而肯定成像探头的景深为1.2mm。

为了表征成像探头的稳定性，我们以典型的平均吸收体——黑色胶带为成像样品中止了测试。将直径5.5 mm，壁厚0.1 mm 的不锈钢管开出345 度的窗口，仅保存15 度的不锈钢部分作为结构支撑。用塑料膜封住窗口构成水囊，将黑胶带样品卷曲掩盖在水囊名义。然后将内窥探头伸入充溢去离子水的水囊中，单向旋转探头对样品中止扫描成像，如图2(b)所示。扫描速度为1 Hz，激起光重复频率调至1.6 kHz，对应光斑在样品上沿着角度方向的步距为10 μm。提取每旋转一周的光声信号峰峰值强度，取得稳定性的量化表征结果，如图2(b)所示。在30 分钟内，计算求得信号颤动RMS=2.5%，这表明探头的激起-探测效率较为稳定，能够在快速旋转扫描中坚持稳定工作。

4 成像结果

图3 健康小动物肠道的光声内窥成像结果。(a) 扫描结构表示图。(b) 直肠内壁血管的三维空间散布。将三维图像展开平铺，

图3 健康小动物肠道的光声内窥成像结果。(a) 扫描结构表示图。(b) 直肠内壁血管的三维空间散布。将三维图像展开平铺，取得图(c-e)中的结果。其中(c)为血红蛋白浓度散布，(d)为血氧饱和度的空间散布，(e)为血管深度散布

我们先对健康小动物肠道中止内窥成像。选择体重约为300 g 的实验用大鼠（SpragueDawley rat），实验前24 小时禁食，以减少肠道内的排泄物。实验时首先对大鼠中止麻醉处置，确保其失去行动才干。整个实验过程中对大鼠中止持续麻醉，一直察看大鼠的生命体征，并恰当控制减少麻醉剂的泵入量。大鼠麻醉后中止灌肠处置，以清算其肠道内的秽物，减少对内窥成像的影响。采用容量为10 mL 的滴管对大鼠肠道重复灌水，当不再有秽物排出且排出的水变得清澈时便能够中止灌肠操作。灌肠时未对动物肠道构成损伤，无出血现象。灌肠用水接近动物正常体温，约为37°C，以减少对肠道的刺激。灌肠后将大鼠放在自反响加热垫上使其体温维持在37.5°C。为了将肠道撑开以减小肠道褶皱对成像血管明晰度的影响，先将带有水囊的套管伸入直肠内，再将成像探头探入，如图3(a)所示。设置步进电机扫描长度为10 mm，B-scan 速度为1 Hz（每秒钟旋转一圈），对大鼠肠道中止全角度扫描，整个成像过程持续约17 分钟。实验中所用激起光脉冲能量为300 nJ，激起光经折射率突变透镜（GRIN 镜）中止聚焦，其焦距为4 mm。图3(b)为由532 nm 单波长激起得到的血红蛋白浓度散布的三维成像结果，沿肠道方向的成像范围为10 mm，展示了大鼠肠道内壁的血管结构。图 3(c-e)为将该图展开后的二维图像，分别为血红蛋白浓度和血氧饱和度的空间散布以及血管深度散布。从图3(e)的深度图能够看到，成像图中血管网络的表层血管与深层血管相距有0.5mm 以上，表明探测深度高于0.5mm。

图3(d)中血氧饱和度的空间散布展示了内壁动静脉血管的散布状况，能够分明的看到直肠内壁动静脉血管的散布状况。图3(e)展示了大鼠肠道内壁血管的分层状况，发现动脉血管大都在浅表层位置，而静脉血管则处在相对更深的位置上。图中下方的横杠来源于不锈钢套管的支撑结构所激起出的光声信号。基于光声显微镜对血氧饱和度的丈量与成像，已有较多研讨和实验考证，这一技术在离体样品[31]、在小动物的脑部[32]、耳部[29]以至肠道[34]都能取得血氧饱和度的空间散布，依据成像结果能够较好地分清动静脉，察看结果与解剖学结构相匹配。这一技术还能用来察看气体及药物产生的刺激响应以至神经-血管耦合现象[35-36]，表明该措施关于血氧饱和度具有较高的丈量精度。关于图3 成像结果中血氧饱和度偏低或者偏高的部分，为肠道组织内残存不洁物质惹起的光学散射所构成的丈量误差。

固然从图3 中看出不锈钢支撑结构的血氧饱和度丈量结果有较大动摇，但需求留意的是，血氧饱和度的光声丈量对象为血红蛋白而非金属资料。由于金属的光学吸收系数很高且具有较强的非线性效应[37-38]。即便是在保险范围的低光强激起状况下仍有可能表示出较高非线性，以至会激起出气泡，构成光声信号强度与激起光强不成正比，其比例系数与聚焦状况密切相关。因而，仅由光声信号强度的丈量结果无法取得金属吸收系数的真实状况。

为了考证成像系统的稳定性，我们对健康大鼠中止了连续7 小时的内窥成像，如图4所示。从成像结果能够看到，在这段时间内肠道血管内血氧饱和度并未呈现明显变更，这表明成像系统具有较好的稳定性。

图4 健康大鼠肠道的光声内窥成像结果。(a) 血红蛋白浓度（血管结构）； (b) 血氧饱和度

图4 健康大鼠肠道的光声内窥成像结果。(a) 血红蛋白浓度（血管结构）； (b) 血氧饱和度

接下来树立脓毒症肠道模型并中止光声内窥成像。我们同样选取体重约为300 g 的大鼠（Sprague Dawley rat）并重复上述步骤。脓毒症模型树立之前先对健康状态下的大鼠肠道中止扫描成像作为基准。然后树立脓毒症模型，取20 mg 的LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）将其稀释于5 mL 水中，取1.5 mL 配置好的溶液注射到大鼠腹腔，每隔1 小时对大鼠肠道同一位置中止扫描。

图5 大鼠肠道脓毒症模型的成像结果。(a) 血管结构变更过程； (b) 血氧饱和度的变更过程

图5 大鼠肠道脓毒症模型的成像结果。(a) 血管结构变更过程； (b) 血氧饱和度的变更过程

图5 为7 小时内对同一目的区域中止多次成像的实验结果，展示了脓毒症惹起大鼠肠道血管结构与血氧饱和度的变更过程。从图5(a)能够看出，大鼠肠道内特别是虚线框区域内的血管数量随着脓毒症发作逐步变少；从图5(b)的结果我们能够看出，其血氧饱和度也呈现降落的趋向，在5 小时左右抵达发病的高峰。上述结果反映了脓毒症惹起的组织灌注缺乏的现象。经过查找相关文献，发现已有体外光声成像装置对脓毒症下的小动物中止了成像研讨。其中上海交通大学应用光声成像发现小鼠脓毒症会惹起耳部的血管数量减少[39]，而加拿大的研讨团队应用光声层析成像察看到了脓毒症鼠模型中脑部血氧的降落[40]，本文应用小巧的内窥探头对肠道以无创方式中止光声内窥成像，发现脓毒症能够在肠道内惹起同样的缺血及缺氧现象[41-42]，契合脓毒症能够惹起全身微循环障碍这一规律。

4 讨论与结论

本文针对肠道内微循环监测需求构建了小型化光纤光声内窥镜，将成像探头伸入活体小动物直肠内以旋转扫描的方式中止内窥成像。探头直径仅2.7 mm，空间分辨率12.5 μm，探头应用光纤超声传感器对光致超声波中止成像，取得了直肠内壁血管结构与血氧饱和度的成像结果。基于数小时连续监测，发现小动物患脓毒症后直肠内壁血管结构与血氧饱和度均发作明显变更。

血氧饱和度是指征微循环状态的重要功用参数，血氧饱和度的光声丈量来源于氧合/无氧血红蛋白在光学吸收谱上的差别，本文的技术计划能够较好地辨认出动静脉并取得疾病状态下的血氧饱和度变更，主要缘由有二：一是采用的激光超声传感用具有高灵活度，能够取得比同尺寸压电探头更高的探测才干。相关研讨表明[29]，血氧饱和度的丈量误差与信噪比直接相关，光声信号丈量的信噪比越高，血氧饱和度就测得越准。而同尺寸下光纤超声传感器的探测灵活度比压电探头要高2 个数量级，所以基于光纤传感器的内窥镜能够提供更为精确的血氧饱和度成像图；二是双波长激起光源均具有较好的稳定性，使光声信号强度的颤动削弱。

本文对小型化光声内窥镜的稳定性中止了丈量，发往常对平均吸收样品的探头的激起-探测误差在 2.5% 以内。在活体成像中，对健康动物的活体血氧饱和度连续7 小时的活体成像，发现其血氧饱和度整体较为稳定。固然存在一些可能由于排泄物等惹起的血氧异常的区域，整体的血氧饱和度还是能客观反映疾病惹起的血氧饱和度变更。未来，我们将继续提升该内窥镜的成像才干和工程化水平，展开大型动物实验研讨，力争早日在临床诊断上取得应用

作者

陈小龙1，梁贻智1,*，仲晓轩1，白雪1，金龙1，黄卫2，黄澄3，牛晓兵4，郭珊珊4，关柏鸥1

1 广东省光纤传感与通讯技术重点实验室，暨南大学光子技术研讨院，广东 广州 511443

2 暨南大学隶属第一医院消化内科，广东 广州 510632

3 广东省人民医院、广东省心血管病研讨所，广东 广州510080

4 广州信筑医疗技术有限公司，广东 广州 510535

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些措施具有较差的空间分辨率及其无法完成动态实时监测等缺陷。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺陷是探测深度相对较低，光子穿透才干受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景普通来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，但是这些散射普通随着光的波长增长呈指数性衰减。

近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（7801000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因而具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率普通可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵活度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研讨提供了一种新的无创检测成像伎俩，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等范畴应用前景普遍。

近红外小动物活体成像

相机部分：

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度抵达-100℃；

2、关于微小信号可完成不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激起光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤散布两侧无死角映照；

3、光纤末端配备准直器，可调激起光的平均映照；

暗室及控制系统：

1、去除背景，完成成像的平场校正功用；

2、调理红外成像窗宽、窗位功用；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、完成资料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与资料单光子寿命剖析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

合适从事生物学、医学、资料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、资料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑剖析等范畴。

应用案例

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、明晰度对比：

【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

经过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片中止160mW cm2808 nm激光激起，当波长在1000~1400 nm之间变更时，血管的明晰度明显进步，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显进步，明晰度显著进步。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试